水稻株高基因克隆及功能分析的研究进展

张云辉，张所兵，林静, 汪迎节，方先文

（江苏省农业科学院粮食作物研究所，江苏南京，210014）

摘 要： 近年来，随着分子生物学技术的不断发展，许多以往报道的和新发现的水稻株高基因得到了克隆，并进行了深入的功能研究。本文介绍了近年来国内外对控制水稻株高基因的克隆以及基因功能分析的研究进展。

关键词： 水稻；株高；基因克隆；功能分析

Research Progress on Cloning and Functional Analysis of Plant Height Genes in Rice (Oryza sativa L.)

Zhang Yunhui, Zhang Suobing, Ling Jing, Wang Yingjie, Fang Xianwen*

（Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China）

Abstract: In recent years, with the continuous development of molecular biology techniques, many previously reported and newly identified rice plant height genes have been cloned, and conducted in-depth functional studies. This paper introduces the research progress on cloning and functional analysis of rice plant height genes in recent years at home and abroad.

Key words: Rice; Plant height; Gene cloning; Functional analysis

0引言

株高是影响水稻产量的一个关键因素，株高超过一定范围容易引起茎秆的倒伏而减产。上世纪50年代开始的水稻半矮秆品种的选育和大面积推广使水稻单产提高了20~30%^[1]，被誉为水稻生产上的第一次“绿色革命”。第一次绿色革命的发生归功于半矮化基因sd1的成功应用。20世纪70至80年代以杂种优势利用为目标的水稻三系育种实现了水稻单产的第二次飞跃，为我国粮食安全提供了重要保障。杂交稻的亲本也多选用半矮化材料，因此矮化育种也是杂交稻成功的关键因素。我国水稻单产在经历矮化育种和杂交稻育种两次大的飞跃后，近30年单产一直停滞不前。为了打破这一局面，以理想株型为模式的超级稻育种提供了重要途径，其主要策略就是理想株型和杂种优势相结合^[2]。由此可见，株型改良是水稻育种的一条主线，而株高是株型改良的关键性状。

然而，目前生产上应用的半矮秆品种都由隐性矮秆基因sd1控制，这种单一基因的广泛应用可能存在遗传多样性丧失的潜在危险，同时携带半矮秆基因sd1 的材料有抗旱性差、光合效应较低等缺点^[3]，从而成为制约水稻新品种选育的瓶颈。因此，在水稻中发掘、鉴定和利用新的矮化基因，开展株高基因定位、克隆和功能研究，阐明其生理生化和分子机制，对水稻育种和生产具有重要的指导意义。

1. 激素对水稻株高起主要调控作用

迄今为止，水稻中已克隆了30多个株高基因。其中，大多数基因与赤霉素、油菜素内酯和独角金内酯等激素的代谢或信号转导有关，表明激素在调节水稻株高中起主导作用。根据矮化突变体对外源激素的反应，可将其分为缺陷型和不敏感型两种类型。缺陷型矮化突变体的激素合成途径被阻断或抑制，使得植物体内内源激素缺乏，用相应的激素体外处理能使矮化表型恢复正常；不敏感型矮化突变体则活性内源激素水平变化不大，甚至还高于野生型，这类突变体体外施用活性激素不能恢复到野生型表型，一般认为这类突变体可能是在激素信号转导途径中发生障碍。

1.1            赤霉素

1.1.1 赤霉素合成途径障碍

赤霉素（Gibberellin，GA）是植物五大类激素之一。 “绿色革命”基因SD1编码GA₂₀氧化酶，催化GA₅₃转变成GA₂₀，它是GA合成途径中的关键步骤。在sd1突变体中，赤霉素合成的前体物质GA₅₃含量显著增加导致有活性的GA₂₀和GA₁减少，植株变矮^[4-6]。半矮化基因d35的来自矮秆品种Tan-Ginbozu，D35编码GA合成初始阶段的内根-贝壳杉烯氧化酶（KO酶）^[7]。另一个矮秆基因d18编码赤霉素3β羟化酶2（GA3ox2），该基因的突变影响了GA的合成，最终导致矮秆表型^[8]。OsKS1编码内根-贝壳杉烯合酶（KS），其转座子（Ds）插入突变体表现严重矮化，不能开花，KS催化赤霉素合成的第二步反应。eui是一个水稻高杆突变体，EUI基因编码一种细胞色素P450单加氧酶，它使有活性的GA₄通过16α，17-环氧化反应而失活，EUI突变后水稻穗颈节大量积累有活性的GA，因此EUI是一个GA去活性酶^[9]。赤霉素2氧化酶（GA2ox）通过2β-羟基化作用使有活性的赤霉素失活，Huang等^[10]分离到一个水稻OsGA2ox6的CaMV 35S增强子标签激活突变体，OsGA2ox6被增强表达后表现显性矮秆，内源活性GA显著降低，外施活性GA能恢复表型。

1.1.2 赤霉素信号途径障碍

GA信号转导途径同样也能影响株高。d1是水稻中发现的最早的赤霉素不敏感突变体，它对外源施加的GA不敏感，且体内GA含量比野生型还高。D1基因编码GTP结合蛋白的α亚基，推测GTP结合蛋白可能在赤霉素信号转导途径中起作用^[11]。已报道的和GA信号途径相关的株高基因还有：高杆基因slr1^[12]、矮秆基因gid1^[13]和gid2^[14]。SLR1是水稻OsGAI^[15]（Ogawa et al., 2000）的同源基因，编码一个包含DELLA结构域的蛋白，和小麦和玉米的“绿色革命”基因RHT-D1a和D8分别有77.2%和80.3%的同源性。slr1突变体幼苗细长，高度为野生型的两倍多，且对赤霉素合成抑制剂反应不敏感^[12]。研究发现DELLA蛋白SLR1是水稻赤霉素信号的抑制子，许多GA响应的诱导是发生在SLR1降解之后^[16]。对水稻赤霉素不敏感突变体gid2（gibberellin insensitive dwarf 2）的分析表明，GID2编码SCF E3复合体的一个F-box亚基，它通过和水稻OsSkp15的互作形成SCF复合体的一个组分；SCF^GID2复合体与磷酸化的SLR1结合，引起泛素介导的SLR1的降解，驱动GA信号的转导。突变体gid2中的SLR1不能正常降解，从而抑制了GA信号向下游的传递，出现严重矮化及不育表型^[14,17]。对另一个赤霉素不敏感突变体gid1（gibberellin insensitive dwarf1）的分析表明，GID1编码一个可溶的赤霉素受体，对具有生物活性的GAs具有高度的亲和性^[13]，推测GID1与有生物活性的GAs结合后获得了与SLR1互作的能力，形成GID1-GA-SLR1复合体，激活了SLR1通过SCF^GID2复合体途径的泛素化降解^[16,18]。

1.2 油菜素内酯

2.1.2 油菜素内酯合成途径障碍

另一植物激素油菜素内酯（Brassinosteriod，BR）也被证明是决定株高的重要激素。植物中BR含量不高但具有非常广泛的生理功能，被誉为植物的第六类生长激素。其最突出的生理功能是促进茎的伸长^[19]。水稻中发现了一系列BR缺陷型突变体，它们的共同特点是外源BR能恢复表型。如brd1是水稻中报道的第一个BR缺陷型突变体，它的茎秆严重矮化、叶鞘缩短、叶片短而卷曲；BRD1编码水稻BR生物合成的一个关键酶：BR C-6氧化酶（OsBR6ox），该酶属于细胞色素P450家族^[20]。d2是另一个BR缺陷型矮秆突变体，D2的编码产物也是BR生物合成过程中的一种关键酶，属于细胞色素P450家族CYP90D类，命名为CYP90D2^[21]。d11表现矮化和种子变短，D11编码细胞色素P450 （CYP724B1），在BR合成途径中起作用^[22]。OsDWARF4 编码细胞色素P450的CYP90B2，催化油菜素内酯生物合成后期步骤的C-22 的羟基化，为BR合成过程中的补充途径，Tos17插入的突变体osdwarf4植株略矮，主要表现为叶片直立。OsDWARF4 与D11 在功能上存在冗余，其单独突变对BR的合成和植株形态影响有限，但由于叶片直立，在密植但不追加更多肥料的情况下，osdwarf4能提高产量^[23]。brd2的表型不似brd1严重，属于半矮秆；BRD2和拟南芥的DIM/DWF1基因同源，催化BR生物合成早期的24-亚甲基胆固醇（24-MC）到菜油甾醇(CR)的反应，同时检测到突变体体内存在一类不常见的BR活性物质DS (dolichosterone)，表明水稻中存在另一条BR合成的补充途径^[24]。

2.1.2 油菜素内酯信号途径障碍

对BR信号转导相关突变体的研究表明，外源施加BR不能恢复其表型。d61突变体对BR的反应不如野生型敏感，是水稻中发现的第一个BR不敏感型突变体。D61与拟南芥的 BRI基因同源，编码BR受体激酶OsBRI1(Brassinosteriod insensitive 1)^[25]。Bai等^[26]（2007）通过对拟南芥中BZR1 (Brassinazole resistant 1)序列同源比对找到了水稻中的同源基因OsBZR1，它的RNA干扰植株表现矮化、直立叶、BR敏感型降低、BR响应基因表达发生变化等，表明它在BR信号中起作用；利用酵母双杂交发现14-3-3蛋白与OsBZR1发生互作，且BR能显著抑制两者的相互作用；14-3-3蛋白与OsBZR1的结合使得OsBZR1滞留在细胞质不行使核功能，抑制了OsBZR1的活性。Tong等^[27]克隆了水稻矮化少分蘖基因dlt（dwarf and low tillering），突变体对BR敏感性降低且体内BR合成基因表达上调。DLT编码一个新的植物特有的GRAS家族蛋白，且OsBZR1能通过BR响应元件结合到DLT的启动子上。最新的研究发现，DLT是水稻BR信号转导负调控因子GSK2激酶的直接下游靶标，被GSK2磷酸化^[28]。

1.3 独角金内酯

近年来，越来越多的研究发现独角金内酯（Strigolactones，SLs）参与调解水稻株高和分蘖。如多蘖矮秆突变体d10，htd1/sd-t，htd2/d88/d14，d27。D10编码类胡萝卜素裂解双加氧酶OsCCD8，与水稻地上分枝抑制因子的合成有关。OsCCD8参与独角金内酯的生物合成^[29,30]。梁国华等^[31]从矮泰引-2中分离鉴定出一个新矮秆基因控制的矮秆材料，将其基因定名为sd-t。Zou等^[32]定位与分析了它的功能，并改名为htd1（high tillering dwarf 1），发现HTD1编码胡萝卜素双加氧酶OsCCD7，与拟南芥侧芽生长抑制基因AtMAX3/CCD7同源，去除腋芽能使突变体株高增高，说明其矮秆表型部分原因是由于过度分蘖造成的。HTD2（亦称D88或D14）编码一个酯酶，抑制水稻分枝发生，可能是独角金内酯信号途径的一个组分，在其下游起作用^[33]，htd2/d88/d14突变体分蘖数增多且矮化^[33-35]。D27编码一个定位于叶绿体的含铁蛋白，是参与独角金内酯合成的一个新成员，突变体d27的根分泌液中检测不到独角金萌发素内酯，导致分蘖芽向外生长的抑制作用被解除，表现矮秆多分蘖^[36]。

1.4 生长素

吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是植物中存在的生长素主要形式，参与植物生长发育的几乎所有方面。植物中IAA的合成主要以色氨酸依赖（tryptophan-dependent）途径为主^[37]。植物对生长素的响应受OsIAA和ARF（auxin response factor）两大蛋白家族调控^[38]。水稻色氨酸缺乏矮化突变体tdd1（tryptophan deficient dwarf 1）在胚胎形成过程中大部分器官发育失败而引起胚胎致死，再生的tdd1突变体表现矮化、窄叶、短根和畸形花。TDD1编码一个与邻氨基苯甲酸合成酶β亚基同源的蛋白，催化色氨酸生物合成的第一步反应，作用于依赖色氨酸的IAA生物合成通路的上游。tdd1突变体的花和胚中的色氨酸和IAA含量都比野生型低。色氨酸处理可以完全恢复突变体的表型，表明tdd1的突变表型主要是由于色氨酸和IAA的缺乏引起^[39]。生长素响应因子OsIAA1的过表达转基因植株表现株高矮化、株型松散，且对24-表油菜素内酯（24-epiBL）的敏感性增加，一些生长素和油菜素内酯响应基因的表达模式也发生变化，表明OsIAA1可能在生长素和油菜素内酯的信号转导交叉中发挥重要作用^[40]。

表1 水稻中克隆的与激素有关的株高基因

Table 1 Hormone-related plant height genes cloned in rice

2. 受其他途径调控的水稻株高基因

水稻中也克隆了其它与株高有关的基因，这些基因的变异引起的表型变化除了矮秆外，往往伴随着许多其它性状，如脆秆、低育、窄叶、卷叶、短穗等。它们所参与的信号通路比较广泛，如细胞壁发育、激素平衡、RNA编辑等，但有的通路依然不明（表2）。D3基因编码含有F-box和富含亮氨酸重复序列蛋白，是拟南芥的MAX2/ORE9的同源蛋白，d3突变体表现矮秆多分蘖^[41]。 Tanaka等^[42]在反转录转座子Tos17插入突变体库中发现三个纤维素合酶催化亚基基因 OsCesA4、OsCesA7、和OsCesA9，它们的突变体表现脆秆、株高半矮化、茎秆变细、育性低等特点，与野生型相比，突变体茎秆中纤维素含量显著降低，但三者在功能上并不冗余，可能共同形成纤维素合成复合体参与次生细胞壁的合成。水稻OGR1基因编码定位于线粒体的三角状五肽重复DYW蛋白，为水稻线粒体转录本的RNA编辑所必需，保证水稻的正常生长发育，在ogr1突变体中，5个线粒体转录本的7个RNA编辑位点存在缺陷，产生各种表型如种子萌发延迟、生长迟缓、矮化和不育^[43]。水稻胞质谷氨酰胺合成酶基因OsGS1的Tos17插入突变体生长和灌浆严重延迟，到成熟期突变体株高明显低于野生型、熟期推迟、灌浆不饱满^[44]。OsGLU1的T-DNA插入突变体glu是一个矮化突变体，表现为细胞伸长减少、纤维素含量降低但果胶含量增加；OsGLU1编码一个可能的膜结合的水稻内切-1,4-β-D-葡聚糖，赤霉素和油菜素内酯可诱导其表达^[45]。OsAP2-39是水稻中类APETALA-2转录因子，其过表达株系表现株高、分蘖数、叶数减少，最终因生物量的减少导致产量下降；表达谱分析表明，过表达植株中ABA合成关键基因OsNCED1和OsNCED3表达上调，内源ABA含量上升，GA去活性基因EUI上调。外源ABA能诱导野生型植株EUI基因的表达，抑制OsAP2-39基因的表达，揭示了OsAP2-39调节水稻中ABA/GA平衡，进而调节植物生长和种子发育^[46]。OsFAD8编码水稻质体ω-3脂肪酸去饱和酶，受低温诱导表达，其T-DNA 插入突变体株高矮化，穗长变短，叶片中的三烯酸脂肪酸的含量降低，对低温胁迫更加敏感，说明OsFAD8 在维持低温胁迫下三烯酸脂肪酸的含量以及耐受低温胁迫中发挥重要作用^[47]。 OsCD1基因编码类纤维素合成酶D亚家族成员，具有糖基转移酶基序，是细胞壁多糖合成所必需；cd1突变体表现矮秆、窄卷叶、穗长和粒数减少、种子细小皱缩，成熟茎中纤维素和木糖含量显著下降，节间细胞长度不变，数量减少^[48]。

表2 水稻中克隆的其它与株高有关的基因

Table 2 Other plant height genes cloned in rice

3. 结语